Molecular Horticulture—陈功友课题组发现柑橘溃疡病菌新的TALE蛋白调控柑橘易感性的新机制

3月14日，Molecular Horticulture在线发表了中心陈功友团队的最新研究成果，题为“Two TAL effectors of Xanthomonas citri promote pustule formation by directly repressing the expression of GRAS transcription factor in citrus”。该团队发现柑橘溃疡病菌中的TALE类效应蛋白PthA5和PthA6通过负调控GRAS家族转录因子CsGRAS9基因表达，从而促进感病的分子机制。同时，利用PTG/Cas9基因编辑系统对暗柳甜橙CsGRAS9启动子上PthA5和PthA6识别的EBE区域进行编辑，获得了对柑橘溃疡病具有抗性的甜橙材料。该研究为解析柑橘溃疡病菌TALE蛋白调控柑橘易感性的分子机制，也为溃疡病抗/耐病性遗传改良提供了理论基础。

背景介绍

柑橘溃疡病（Citrus bacterial canker，CBC）是一种细菌性病害，由柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri）引起，在热带和亚热带地区对柑橘生产造成严重威胁。我国是柑橘的起源地之一，栽培品种类型繁多，其中枸橼/香橼类（Citrus medica）和金柑属（Fortunella）品种具较强的抗病性，而葡萄柚（C. paradisi）和甜橙类（C. sinensis）则易受溃疡病菌侵染。黄单胞菌属植物病原菌通过Ⅲ型分泌系统将类转录激活子效应蛋白（transcription activator-like effector, TALE）注入寄主细胞并转运至细胞核。TALE蛋白通过中间重复序列区（central repeat region, CRR）识别并结合宿主靶基因启动子上的效应蛋白结合元件（effector-binding element，EBE）调控基因的表达。前期研究发现，金柑中分离获得的Xcc086菌株中含有TALE蛋白PthA5，葡萄柚中分离获得的Xcc003菌株中含有TALE蛋白PthA6，但二者的功能尚不明确。研究柑橘溃疡病菌TALE蛋白在病原菌—寄主互作过程中的作用机制，挖掘并利用抗/感病相关基因，为培育抗病柑橘品种提供理论基础，对柑橘溃疡病抗性育种具有重要意义。 

研究结果

本研究发现PthA5和PthA6是柑橘溃疡病菌的毒力因子，能够促进柑橘叶片上溃疡症状的形成（Fig.1）。回补PthA5和PthA6的TALE全敲除突变体菌株Xcc049E在葡萄柚上的致病性显著提高。叶片叶肉细胞超微结构观察显示，叶肉海绵组织结构被严重破坏以致难以区分。通过Tn5转座子体外随机插入获得PthA5和PthA6的中心重复区序列。基于TALE蛋白与DNA结合的特异性功能多样性，以及RVD序列的生态多样性，通过FuncTAL和DisTAL分析工具发现，PthA5和PthA6是PthA1的同源物，由祖先基因之间的重组事件形成，揭示了TALE蛋白在进化过程中的功能多样性。

Fig.1 PthA5和PthA6对柑橘溃疡病症状发展的影响。

 利用Target Finder和AnnoTALE工具预测PthA5和PthA6识别的DNA结合位点（EBEs），并鉴定到柑橘GRAS转录因子CsGRAS9是它们的候选靶标基因。基因表达分析表明，CsGRAS9的表达受PthA5和PthA6显著抑制（Fig.2）。为了解析PthA5和PthA6对CsGRAS9的调控机制，通过双荧光素酶和GUS报告基因、酵母单杂交、凝胶迁移等分析证明，PthA5和PthA6能够直接结合CsGRAS9启动子上的EBE区域，进而抑制其表达。进一步的研究发现，抗病品种山金柑FhGRAS9启动子自然变异导致EBEs序列的删除，逃避PthA5和PthA6介导的转录抑制，使其表达不受影响。

Fig.2 PthA5和PthA6直接结合CsGRAS9启动子的EBE区域负调控其表达。

 CsGRAS9定位于细胞核，具转录激活活性。本研究通过人工设计的类转录激活物效应子dGRAS9成功诱导CsGRAS9的表达（Fig.3）。过表达CsGRAS9可以增强柑橘对溃疡病的抗性并调控CsTAC1和GA生物合成相关基因的表达。

Fig.3 CsGRAS9亚细胞定位、转录激活活性和功能分析。

同时，利用PTG/Cas9转化暗柳甜橙上胚轴对CsGRAS9启动子EBE区域进行编辑，获得了CsGRAS9启动子编辑品系，且未检测到脱靶突变。其中1个品系为双等位基因/纯合突变体。通过对CsGRAS9启动子EBE区域的大片段删除，暗柳甜橙编辑品系表现对柑橘溃疡病菌的抗性。细菌生长量实验表明，溃疡病菌在编辑系中的生长受到抑制（Fig.4）。

Fig.4 PTG/Cas9系统编辑CsGRAS9启动子获得具溃疡病抗性的甜橙编辑植株。

 本研究揭示了TALE蛋白通过调控GRAS9s基因的表达，影响柑橘对溃疡病抗性的分子机制。结合PTG/Cas9基因编辑技术和启动子自然变异的鉴定，成功获得具溃疡病抗性的甜橙编辑品系，为柑橘抗性育种提供理论支持和基因资源。

上海交通大学农业与生物学院博士研究生阎依超和华中农业大学园艺林学学院汤小美博士（现工作单位安徽农业大学）为论文共同第一作者，上海交通大学农业与生物学院邹丽芳副教授为通讯作者，上海交通大学农业与生物学院陈功友教授和华中农业大学园艺林学学院徐强教授参与并指导了本研究。本研究得到了国家重点研发计划（2022YFD1400200）和国家自然科学基金面上项目（31772122）的资助。感谢中国科学院遗传与发育生物研究所谢旗研究员提供柑橘基因编辑的PTG/Cas9载体，感谢华中农业大学园艺林学学院邓秀新院士提供山金柑材料。